Produkce a biochemická charakterizace lakázy NRC 620 z hlívy ústřičné a hodnocení její účinnosti při čiření jablečné šťávy.

Po 25 dnech statické inkubace při 28 °C vykazovala lakáza z *Pleurotus ostreatus* NRC620 nejvyšší aktivitu v kultivačním médiu hub. Optimální hodnoty pH a teploty pro tento enzym byly 3,0 a 70 °C. Po 2 hodinách inkubace při 40 °C a 50 °C si aktivita enzymu zachovala 68,33 %, respektive 59,61 %. Po 2 hodinách inkubace v citrát-fosfátovém pufru (pH 7,0) zůstala aktivita enzymu na 100 %. Přidání 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ zvýšilo aktivitu enzymu přibližně o 21 %, respektive 35 %, zatímco NaCl, MnCl₂, KCl a CaCl₂ aktivitu enzymu inhibovaly. Při použití ABTS jako substrátu byly kinetické parametry (Km a Vmax) lakázy *Pleurotus ostreatus* NRC 620 1,99 mM a 16 217 μmol min−1 L−1. Enzymatické ošetření vzorků jablečné šťávy významně snížilo jak pH, tak viskozitu a toto snížení korelovalo s prodloužením doby skladování. Ošetření lakázou vedlo k mírnému poklesu celkového obsahu fenolů v jablečné šťávě, ale nebylo pozorováno žádné snížení antioxidační aktivity.
V posledních letech se výzkumníci zaměřují na aplikaci zelené biotechnologie v potravinářském průmyslu. Lakáza je jedním z nejužitečnějších enzymů v potravinářském průmyslu a nachází uplatnění v oblastech, jako je zpracování šťáv, pečení, stabilizace vína a zlepšení organoleptických vlastností potravinářských výrobků.¹Mnoho vyšších rostlin a mikroorganismů vylučuje lakázu,²a houby, jako jsou deuteromycety, vřeckomycety a basidiomycety, mohou také produkovat lakázu.³Lakáza (EC 1.10.3.2) je modrá oxidáza, která redukuje molekulární kyslík na vodu pomocí systému sestávajícího ze tří různých atomů mědi, čímž oxiduje různé fenolové sloučeniny a aromatické aminy. Během výroby ovocných a zeleninových šťáv je enzymatické a neenzymatické hnědnutí kritickým faktorem.⁴Protože tyto látky negativně ovlivňují barvu, chuť a vůni šťávy, musí být odstraněny.⁵
Ze všech druhů ovoce jsou jablka nejvíce konzumována na celém světě a v Evropské unii. V roce 2019 se produkce jablek umístila na třetím místě v celosvětové spotřebě přes 87 miliony tun.⁶Jablka obsahují řadu fenolických sloučenin, včetně flavonoidů a fenolických kyselin, jako je kyselina kávová a kyselina chlorogenová.⁷Protože se jablečná šťáva obvykle konzumuje v čiré formě, během filtračního procesu se ztrácí přibližně 50 % až 90 % fenolických složek.⁸Dnes mají spotřebitelé tendenci vybírat minimálně zpracované produkty, jako je například zakalená jablečná šťáva s vysokým obsahem polyfenolů. Vzhledem k vysokému obsahu fenolů je však tento druh jablečné šťávy obzvláště náchylný k zabarvení a tmavnutí.⁹K omezení nebo zabránění ztmavnutí jablečné šťávy se používají různé technologie, včetně metod tepelného zpracování, jako je pasterizace při 60–90 °C.¹⁰Nicméně podle výzkumu Sauceda-Gálveze¹¹Tepelné zpracování může zničit těkavé chemické látky a ovlivnit organoleptické vlastnosti jablečné šťávy. Alternativy k metodám tepelného zpracování zahrnují superkritický oxid uhličitý, ultrafialové záření, ultrazvuk, vysoký hydrostatický tlak nebo homogenizaci za vysokého tlaku.¹²Účinnost těchto technologií a výtěžnost vhodných ovocných šťáv závisí na použitých parametrech a vlastnostech produktu. Jejich široké použití je omezeno vysokými náklady, nepříznivými vlivy na kvalitu některých potravinářských výrobků nebo nedostatečnou inaktivací enzymů.^13,14
Lakáza se může použít ke stabilizaci a čiření ovocné šťávy.¹⁵Gökmen a kol.¹⁶Doporučují použití lakázy pro čiření ovocných šťáv, protože účinně odstraňuje fenolové sloučeniny jejich přeměnou na polymery nebo oligomery, které lze snadno odstranit jakoukoli ultrafiltrační membránou, což umožňuje jablečné šťávě udržet si stabilní barvu a čirost až šest týdnů při teplotě 50 °C. Čištěná lakáza *Trichoderma* byla imobilizována na kuličkách oxidu hlinitého a použita k selektivnímu odstranění nežádoucích látek způsobených mikrobiální kontaminací jablečné šťávy.¹⁷
Přibližně 80–90 % těkavých složek jablečné šťávy tvoří estery a aldehydy, které šťávě dodávají jedinečné aroma.¹⁸Lakáza z *Trametes versicolor* byla imobilizována na levném nosiči vyrobeném z přírodních vláken z mladých kokosových skořápek pro účely čiření jablečné šťávy.¹⁹Předchozí studie zkoumaly stabilizaci jablečné šťávy (barva a zákal) pomocí bezenzymových nebo imobilizačních metod, případně v kombinaci s ultrafiltrací.^5,19Vliv houbových lakáz na fyzikálně-chemické vlastnosti jablečné šťávy během skladování však zůstává nejasný. Cílem této studie proto bylo experimentálně zkoumat změny fyzikálně-chemických vlastností, obsahu fenolických sloučenin a antioxidační aktivity jablečné šťávy po ošetření houbovými lakázami a dvoutýdenním skladování v chladničce. Lakázy mají schopnost oxidovat fenolové sloučeniny, což je činí slibnými pro použití v různých průmyslových procesech, včetně čiření šťávy. Tato studie zkoumala lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 a zaměřila se na ideální podmínky pro jejich aktivitu a účinnost při čiření šťávy. Zatímco výzkum hlívy ústřičné (P. ostreatus NRC 620) je stále omezený, předchozí studie zkoumaly enzymy z různých houbových zdrojů, jako je Trametes versicolor a Ganoderma lucidum. Cílem této studie bylo zhodnotit potenciální využití tohoto enzymu v potravinářském průmyslu a zdůraznit jeho jedinečné vlastnosti, zejména jeho ideální pH a teplotu.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) (ABTS) byla zakoupena od společnosti Sigma-Aldrich (Kanada). Všechny ostatní činidla byla analytické kvality.
Sběrné centrum mikrobiálních kultur Národního výzkumného centra získalo známý kmen hlívy ústřičné NRC620. Po subkultivaci byl tento kmen skladován na šikmých plotnách bramborového dextrózového agaru při 4 °C. Způsob přípravy inokula byl následující: 10 dní staré, plně vyvinuté mycelium bylo naočkováno na plotny s bramborovým dextrózovým agarem a inkubováno při 28 °C. Po 10 dnech byly z agarového média pomocí sterilní kovové raznice vyjmuty tři myceliové bloky o průměru 12 mm a umístěny do 250ml Erlenmeyerových baněk s vatovými zátkami obsahujících 50 ml sterilizovaného kultivačního média (pH 5,0, jak bylo dříve popsáno Othmanem a kol.).²⁰). Kultury byly inkubovány při 28 °C po dobu 18 dnů. Kultury byly poté filtrovány přes filtrační papír Whatman č. 1 a výsledný supernatant sloužil jako zdroj enzymu.
Aktivita lakázy byla stanovena za použití ABTS jako substrátu. Reakční směs (2 ml) obsahovala 500 μl 0,3 mM ABTS (rozpuštěného v 0,1 M citrátovém pufru sodném, pH 4,5) a požadované množství vzorku enzymu zředěného destilovanou vodou.^21,22Vzhledem k tomu, že lakáza může oxidovat ABTS při pokojové teplotě (28 °C ± 2), byla oxidace ABTS stanovena měřením zvýšení absorbance při 420 nm (ε₄₂₀= 36 000 cm^-1 M ^-1) za použití UV spektrofotometru Agilent Carry-100. K oxidaci 1 μmol ABTS za minutu byla zapotřebí jedna jednotka lakázové aktivity. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou s použitím bovinního sérového albuminu jako interní kontroly.^23,24
Po získání enzymu z kmene hlívy ústřičné NRC 620 byla jeho aktivita měřena v různých kultivačních intervalech po dobu 25 dnů za statických podmínek při 28 °C.
Pro studium vlivu teploty na aktivitu lakázy byly provedeny experimenty v teplotním rozmezí od 20 do 90 °C. Před přidáním enzymu a zahájením reakce byly pufr (0,1 M citrát sodný, pH 4,5) a substrát (ABTS) smíchány a inkubovány po dobu 5 minut při různých teplotách. Tepelná stabilita enzymu byla hodnocena inkubací v 0,05 M pufru fosforečnanu sodného (pH 7,0) při 40, 50, 60 a 70 °C po dobu 2 hodin. Zbytková aktivita byla poté hodnocena pomocí substrátu ABTS.
Vliv pH na aktivitu lakázy byl hodnocen za použití ABTS jako substrátu v 0,1 M citrát-fosfátových pufrech s rozsahem pH 2,5 až 7,0. Roztok enzymu byl inkubován při 40 °C po dobu dvou hodin v 0,1 M citrátovém a Tris pufru (pH 3, 4, 6 a 7) za účelem posouzení stability pH. Zbytková aktivita s ABTS jako substrátem byla vypočtena po inkubaci.
Lakáza byla inkubována po dobu 10 minut v pufru s fosforečnanem sodným (0,05 M, pH 7,0) obsahujícím různé kovové ionty (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ a Mn2+) v koncentracích 2,5 mM a 10 mM. Poté byl přidán substrát (ABTS) pro zahájení reakce a byla vyhodnocena relativní aktivita.
Oxidace ABTS lakázou při různých koncentracích (0,025–3 mM) byla měřena při pH 4,5 za účelem stanovení kinetických parametrů (Vmax a Km). Kinetika^konstantyPercenta Michaelisovy-Mentenovy rovnice byla vypočtena pomocí Lineweaver-Burkova grafu, který znázorňuje převrácenou hodnotu reakční rychlosti jako funkci koncentrace substrátu. Kinetické konstanty byly vypočteny z Lineweaver-Burkova grafu pomocí softwaru GraphPad Prism verze 6.01.
Po důkladném omytí jablek vodou z vodovodu byla rozkrojena napůl a odšťavněna pomocí plně automatického odšťavňovače jablek Braun MP80 (vyrobeného v Německu). Šťáva byla přefiltrována přes čtyři vrstvy gázy. Kontrolní skupině nebyly přidány žádné enzymy, zatímco do čerstvě připravené jablečné šťávy bylo přidáno 2,0 % lakázy (nejúčinnější testovaná koncentrace) a poté byla skladována dva týdny při teplotě 4 °C.
Titrační kyselost (TA) a pH byly stanoveny metodou Boultona a^al.27Hodnota pH každého vzorku byla měřena pomocí digitálního pH metru (pH metr JENWAY 3510). Titrační kyselost (TA) byla vypočtena na základě kyseliny jablečné pomocí následujícího vzorce.
Kde V a C jsou objem (ml) a koncentrace (0,1 mol/l) roztoku hydroxidu sodného použitého při titraci. K je konverzní koeficient kyseliny jablečné, rovný 0,067, a W je hmotnost (g) jablečné šťávy.
Celkové množství rozpustných pevných látek (^TDS) obsah ve všech vzorcích šťávy byl stanoven pomocí kapesního refraktometru PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japonsko). Po každém měření byla optická čočka opláchnuta deionizovanou vodou a každý vzorek jablečné šťávy byl testován třikrát. Hodnota pro každý vzorek byla vypočtena zprůměrováním tří měření. Průměr ± směrodatná odchylka pro každý vzorek jablečné šťávy byla také vypočtena zprůměrováním těchto výsledků.
Viskoelasticita vzorků jablečné šťávy byla hodnocena pomocí rotačního viskozimetru (RV, Rheotest 2, Německo). Vzorek byl umístěn do válce „S2“ viskozimetru. Zdánlivá viskozita byla vyjádřena sklonem křivky smykového napětí versus smyková rychlost, která byla vypočtena ze smykového napětí a odpovídajících křivek při různých smykových rychlostech (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Vzorec pro výpočet zdánlivé viskozity je následující:
Kde η je zdánlivá viskozita (cP), τ je smykové napětí (dyn/cm²), γ je smyková rychlost (s⁻¹) a (τ) se vypočítá s použitím hodnot točivého momentu (α) a válce (Z) podle následujícího vzorce: τ = Z . α.
Index hnědnutí byl stanoven metodou Meidav ​​et al.^al.29Vzorek šťávy o objemu 10 ml byl centrifugován při 2750 xg po dobu 10 minut. 5 ml supernatantu šťávy bylo smícháno s 5 ml 95% ethanolu. Absorbance směsi byla měřena při 420 nm pomocí UV spektrofotometru Shimadzu (UV-1601 PC).
Celkový obsah fenolů (TPC) byl stanoven kolorimetricky za použití Folin-Ciocalteuova činidla dle popisu Boultona a kol.^[27]]. Standardní křivka kyseliny gallové byla sestrojena pro koncentrace od 0 do 500 mg/l (^r²= 0,997). Výsledky jsou vyjádřeny jako ekvivalenty kyseliny gallové (mg GAE/ml).
Přidejte 125 μl destilované vody a 2850 μl roztoku FRAP k 25 μl jablečné šťávy a nechte směs ve tmě po dobu³⁰min. Poté změřte absorbanci při 593 nm pomocí UV spektrofotometru Shimadzu (UV-1601 PC). Reagencie FRAP byla připravena smícháním 300 mM acetátového pufru (pH 3,6), 20 mM chloridu železitého a 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazinu (TPTZ) (rozpuštěného ve 40 mM HCl) v poměru 10:1:1. Standardní křivka byla vytvořena s použitím Troloxu jako standardu (^R²= 0,999) a výsledky jsou vyjádřeny jako μM Troloxu/ml.
Antioxidační aktivita ošetřených a neošetřených šťáv byla stanovena metodou DPPH za účelem vyhodnocení jejich schopnosti zachycovat volné radikály DPPH.³¹Deset mikrolitrů šťávy bylo smícháno s 1 ml roztoku DPPH (100 μM) v methanolu. Po 30minutové reakci ve tmě byla absorbance směsi měřena při 517 nm pomocí UV spektrofotometru Shimadzu (UV-1601 PC). Výsledky byly vyjádřeny jako ekvivalenty troloxu (μM troloxu/ml) na základě kalibrační křivky (_^R2= 0,990).
Získaná data ukázala, že maximální produkce lakázy byla u hlívy ústřičné NRC 620 pozorována do konce 18. dne fermentace, kdy dosáhla aktivity 1302 U/l. To sloužilo jako základ pro stanovení optimální doby kultivace pro produkci lakázy (obrázek 1). Ačkoli produkce enzymu s prodlužující se dobou kultivace rostla, rychlost nárůstu nebyla přímo úměrná době kultivace; po 21 dnech se aktivita enzymu zvýšila pouze o 90 U/l (na 1390 U/l). Proto byla nakonec jako optimální doba kultivace zvolena doba 18 dní, aby se vyvážil výtěžek produktu s ekonomickými výhodami prodloužené doby kultivace.
Vliv doby kultivace na výtěžek lakázy u Pleurotus ostreatus NRC 620. Tři (12 mm) bloky mycelia hub byly naočkovány do 50 ml sterilního média a poté kultivovány při 28 °C po různou dobu.
V souladu s jinými studiemi naše výsledky naznačují, že ideální doba kultivace pro dosažení vrcholu sekrece lakázy houbami je pravděpodobně mezi 7 a 36 dny.³²Podle Ezike a kol.³³*Trametes polyzona* WRF03 produkoval nejvyšší množství lakázy do konce devátého dne fermentace se specifickou aktivitou 1637 U/mg proteinu. Othman a kol.³⁴zjistili, že *Trichoderma harzianum* S7113 vylučovala velké množství lakázy pátý den kultivace. Rychlost produkce lakázy dosáhla vrcholu čtrnáctý den a poté postupně klesala.³⁴Ačkoli sekrece enzymů může vyskytovat i během hlavní růstové fáze, obvykle vrcholí během přechodné fáze a je spouštěna spotřebou zdroje uhlíku nebo dusíku.^34,35
Ačkoli lakáza z Pleurotus ostreatus NRC 620 vykazovala vysokou aktivitu v širokém teplotním rozmezí od 50 °C do 80 °C, blížila se vrcholu aktivity (69–98 %), její maximální aktivita byla pozorována při 70 °C (obr. 2a). Mimo toto teplotní rozmezí se aktivita enzymu snížila přibližně při 70 °C. Tyto výsledky naznačují, že enzym je aktivní při vysokých teplotách, pravděpodobně proto, že vysoká teplota zvyšuje kinetickou energii reakce.
Vliv reakční teploty (a) a pH (b) na aktivitu lakázy v *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Teploty v rozmezí od 20 do 90 °C byly dosaženy preinkubací směsi při různých teplotách po dobu 5 minut před přidáním enzymu a zahájením reakce. Vliv pH na aktivitu lakázy byl hodnocen za použití ABTS jako substrátu v roztocích obsahujících 0,1 M citrát-fosfátový pufr v rozmezí pH 2,5 až 7,0.
Podle Ezike a dalších^al.33Optimální teplota pro lakázu *Trametes polyzona* WRF03 je 55 °C, což je stejná teplota jako pro *Ganoderma lucidum*^laccase36a podobná optimální teplotě (50 °C) pro *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakáza . ^Baldrian38poznamenává, že stejně jako u jiných enzymových systémů degradujících lignin je ideální teplotní rozmezí pro lakázu mezi 50 a 70 °C.
Výsledky ukázaly, že enzym vykazoval nejvyšší aktivitu při pH 3,0 a dosáhl 94% aktivity při pH 3,5. Zůstal však aktivní v širokém rozmezí pH od 2,5 do 7,0 (obrázek 2b). Dále vykazoval vyšší aktivitu v kyselých podmínkách ve srovnání s neutrálními nebo alkalickými podmínkami. Jeho aktivita zůstala alespoň 77% v rozmezí pH od 2,5 do 4,5, ale při pH 7,0 dosáhla pouze přibližně 38%. Optimální pH pro lakázu z *Trametes polyzona* WRF03 bylo 4,533, což je stejné jako pH pro lakázy z *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 a *Trametes hirsuta* 41. Nicméně podle studie Chairina a kol.⁴²Optimální pH pro lakázu z *Polymorpha f. sp.* WR710-1 je 2,2, zatímco optimální pH pro lakázu z *Polymorpha f. sp.* IBL-04 je 5,043. Vazba hydroxidových aniontů (inhibitor lakázy) na atomy mědi lakázy T2/T3 může být důvodem snížené aktivity lakázy za neutrálního nebo alkalického pH. To může narušit vnitřní přenos elektronů z centra T1 do centra T2/T3, a tím...^omezujícíaktivita enzymu23,44
Inkubací enzymu při různých teplotách bylo zjištěno, že jak doba inkubace, tak teplota ovlivňují stabilitu enzymu. Zejména lakáza z *Trametes polyzona* NRC 620 vykazovala vyšší stabilitu při 40 °C a 50 °C, přičemž si po 120 minutách zachovala 68,33 %, respektive 59,61 % své počáteční aktivity (obrázek 3a). Naproti tomu za stejných podmínek (40 °C a 50 °C, 120 minut) si lakáza z *Trametes polyzona* WRF03 zachovala 64,38 %, respektive 42,92 % své aktivity.³³Naopak, zvyšující se doba inkubace a teplota snížily stabilitu lakázy *Trametes polyzona* NRC 620; po inkubaci při 60 °C a 70 °C po dobu 60 minut se její aktivita snížila na 39,24 %, respektive 1,72 % (obrázek 3a). V souladu s experimentálními výsledky vykazovala lakáza z *Trametes polyzona* WRF03 vyšší stabilitu při 40 °C a 50 °C během celého procesu tepelného zpracování.³³Podobně Lueangjaroenkit a další^al.37a předseda a další^al.42uvádějí stabilitu lakáz z Trametes polyzona KURNW027 a Trametes polyzona WR710-1 při 50 °C po dobu 1 hodiny. Jako užitečný biokatalyzátor použitelný v různých biotechnologických oblastech by lakáza měla mít dobrou stabilitu a výkon v širokém teplotním rozsahu.
Termostatická stabilita (a) a pH stabilita (b) lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatická stabilita byla hodnocena inkubací roztoku enzymu v 0,05 M pufru fosforečnanu sodného (pH 7,0) při 40, 50, 60 a 70 °C po dobu 2 hodin. Stabilita pH byla hodnocena inkubací roztoku enzymu v 0,1 M citrátovém pufru a Tris pufru (pH 3, 4, 6 a 7) při 40 °C po dobu 2 hodin. Zbytková aktivita byla vypočtena s použitím ABTS jako substrátu po inkubaci.
Pro stanovení optimálních podmínek pro použití a skladování enzymu jsme zkoumali vliv pH na stabilitu lakázy. Vystavení různým hodnotám pH významně ovlivnilo stabilitu proteinové struktury, a tím i stabilitu a aktivitu molekuly enzymu. Výsledky ukázaly, že enzym byl méně stabilní v kyselých podmínkách, zatímco lepší stabilitu vykazoval při vyšších hodnotách pH (neutrální a alkalické oblasti). Při hodnotách pH 7,0, 6,0, 4,0 a 3,0 byla míra retence enzymu po 120 minutách přibližně 100 %, 62,54 %, 52,39 % a 11,14 % (obr. 3b). Lakáza *Strombus multisus* WRF03 vykazovala vyšší stabilitu při neutrálních hodnotách pH (5,5–6,5) a nižší stabilitu při kyselých hodnotách pH (pod 4,0). Po 120 minutách při hodnotách pH 5,5, 6,0 a 6,5 ​​byla míra retence enzymů přibližně 82 %, 100 % a 93 %.³³Khairin a kol.⁴²poznamenali, že lakáza z Trametes polyzona WR710-1 byla stabilní v rozmezí pH 6,0 až 7,0, zatímco Sayed a kol.⁴⁵ukázaly, že lakáza byla stabilnější za podmínek neutrálního pH. Lakáza z Cerrena unicolor však vykazovala stabilitu i za alkalických podmínek (pH 9,0).⁴⁶Studované lakázy vykazovaly vysokou stabilitu v širokém rozsahu pH. To může být důležitá vlastnost pro průmyslové aplikace.
Vzhledem k tomu, že některé kovové ionty mají jak stimulační, tak inhibiční účinky na aktivitu enzymů, je nutné jejich vliv na aktivitu enzymů zohlednit v průmyslových aplikacích. To je zásadní, protože kovové ionty jsou běžnými kontaminanty životního prostředí, které mohou ovlivnit stabilitu a syntézu extracelulárních enzymů.⁴⁷Abychom prozkoumali vliv více kovových iontů na lakázu z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, provedli jsme odpovídající experimenty. Jak je znázorněno na obrázku 4, v závislosti na typu použitého kovu mělo zvýšení koncentrace kovových iontů z 2,5 mM na 10 mM negativní vliv na funkci enzymu. Například^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺a^Cu²⁺mohl stimulovat a aktivovat aktivitu enzymů, zatímco^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺a^K⁺mohl inhibovat aktivitu enzymu. Při koncentraci 10 mM byly ionty Cu²⁺ a Mg²⁺ nejúčinnějšími aktivátory lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, přičemž dosáhly stupně aktivace přibližně 34 %, respektive 20 %. Při koncentraci 10 mM však byly ionty Ca²⁺ nejúčinnějším inhibitorem lakázy, přičemž snižovaly aktivitu enzymu přibližně o 60 %.
Vliv kovových iontů na aktivitu lakázy Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakáza byla inkubována po dobu 10 minut v pufru fosforečnanu sodného (0,05 M, pH 7,0) obsahujícím různé kovové ionty v koncentracích 2,5 mM a 10 mM. Reakce byla poté zahájena přidáním substrátu (ABTS), po kterém byla změřena relativní aktivita.
Naše výsledky jsou v souladu s výsledky jiných autorů, kteří zjistili, že Mg²⁺ a Cu²⁺ zvyšují aktivitu *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño a kol.⁴⁸ zjistili, že lakáza z *Xylaria* sp. je do určité míry stimulována ionty mědi (Cu²⁺). Foroutanfar a kol.⁴⁹ a Si a kol.⁵⁰ dále provedli podobné studie s lakázami z *Paraconiothyrium variabile* a *Trametes pubescens*. Vazebné místo pro měď typu II (T2) tohoto enzymu může být při dané koncentraci nasyceno Cu²⁺, což může vysvětlovat stimulaci aktivity lakázy při vyšších koncentracích Cu²⁺³⁹. Vzhledem k tomu, že lakázy bílých hub jsou oxidázy obsahující více atomů mědi, jsou účinky iontů mědi na aktivitu lakázy rozmanité a sahají od stimulačních a inhibičních až po neutrální.⁵¹ Naproti tomu Zhou a kol.^[52]uvedl, že^Cu²⁺inhiboval lakázovou aktivitu tchajwanského podzemního termita (Odontotermes formosanus). Nicméně lakázy Cerena sp. HYB07^[53]a Clitocybe maxima^[54]nebyly ovlivněny ionty mědi.
Specifičnost substrátu byla reprezentována jeho kinetickými parametry (Km a Vmax); čím silnější je vazebná afinita substrátu k enzymu, tím nižší je hodnota Km a tím vyšší je specificita substrátu.^3,21,55Kinetické parametry (Km a Vmax) lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 byly stanoveny pomocí softwaru GraphPad Prism 6.0 vykreslením Lineweaver-Burkova grafu (obrázek 5). Při použití ABTS jako substrátu byly výsledky 1,99 mM a 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}Elsayed a kol.²¹uvádí, že hodnoty Km pro oxidaci ABTS byly 0,1 mM a 0,064 mM, což naznačuje vysokou afinitu izoenzymů Lac A a Lac B k ABTS. Hodnoty Vmax byly navíc 0,182 μmol.^min⁻¹a 0,603 μmol^min⁻¹, v uvedeném pořadí. Získaná hodnota Km byla nižší než u Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); navíc byla jejich hodnota Vmax (1429 mmol min⁻¹) také^spodnípři použití ABTS jako substrátu.33 Podobně byly hodnoty Km ​​koncentrací lakázy u Lentinus squarrosulus MR13 a Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM a 0,025 mM a hodnoty Vmax ​​byly 0,0091 mM min−1 a 0,67 mM min−1 mg−1 (vzhledem k ABTS).^{, respektive.56,57}
Byl zkoumán vliv koncentrace ABTS na aktivitu lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 a byl vynesen Lineweaver-Burkův graf převrácené hodnoty počáteční reakční rychlosti v závislosti na koncentraci ABTS. Oxidační reakce ABTS s různými koncentracemi lakázy (0,025–3,0 mM) byla měřena při pH 4,5 za účelem stanovení kinetických parametrů (Vmax a Km). Michaelis-Mentenovy kinetické konstanty byly vypočteny pomocí Lineweaver-Burkova grafu převrácené hodnoty reakční rychlosti v závislosti na koncentraci substrátu. Kinetické konstanty byly vypočteny z Lineweaver-Burkova grafu pomocí softwaru GraphPad Prism 6.01.
Tradiční čiřící enzymy, jako jsou pektinázy, hydrolyzují pektinové látky, čímž snižují viskozitu a zákal. Účinně rozkládají strukturní polysacharidy a často se používají v kombinaci s dalšími enzymy, jako jsou celulázy a hemicelulázy, ke zlepšení výtěžnosti a čirosti. Pektinázy se však specificky nezaměřují na fenolické sloučeniny, které jsou hlavními příčinami zákalu a oxidačního hnědnutí, zejména u šťáv, jako je jablečná a hroznová.⁵⁸Naproti tomu lakázy katalyzují oxidaci fenolických sloučenin a polymerují je na větší, nerozpustné molekuly, které lze odstranit sedimentací nebo filtrací. Tento mechanismus nejen zlepšuje čirost, ale také prodlužuje trvanlivost šťávy snížením pravděpodobnosti oxidačního hnědnutí způsobeného fenolickými sloučeninami. Procesy čiření na bázi lakáz lze navíc provádět za mírných podmínek zpracování (pH 3,5–5,5, teplota 25–40 °C), což je činí vhodnými pro jemné šťávy, aniž by byly ohroženy jejich nutriční nebo organoleptické vlastnosti.⁵⁹Studie ukázaly, že ošetření pektinázou může vyčeřit šťávu za 1–2 hodiny, zatímco ošetření lakázou obvykle vyžaduje delší reakční dobu (3–6 hodin) k úplné redukci fenolických sloučenin. Tento proces však lze optimalizovat imobilizací enzymu nebo kombinací lakázy s mechanickými metodami čištění.⁶⁰V této studii enzymatické profilování surového extraktu odhalilo významnou aktivitu lakázy a α-amylázy, zatímco aktivita pektinázy a xylanázy byla extrémně nízká a aktivita celulázy nebyla detekována. Snížení zákalu a obsahu fenolů bylo proto způsobeno především působením lakázy, zatímco změna viskozity by mohla být částečně způsobena působením amylázy.
Tabulka 1 ukazuje fyzikálně-chemické parametry čerstvě vymačkané jablečné šťávy a vzorků ošetřených lakázou. Výsledky ukázaly, že výtěžek čerstvě vymačkané jablečné šťávy (71,59 %) byl nižší než u vzorků ošetřených lakázou (87,34 %). Tyto výsledky jsou v souladu se zjištěními Pilníka a Orange.⁶¹, který uvedl, že použití enzymů při zpracování ovoce může zvýšit výtěžnost šťávy, zlepšit filtraci a získat vysoce kvalitní, čirou šťávu pro zahuštění. Zvýšení výtěžnosti šťávy je způsobeno především zvýšením obsahu rozpustných cukrů ve šťávě. Během enzymatické hydrolýzy ovoce se mezoglea a pektin v buněčných stěnách produktu ničí a přeměňují na rozpustné látky, jako jsou neutrální cukry a kyseliny.^62.Hodnota pH jablečné šťávy ošetřené enzymy byla významně nižší než u kontrolní skupiny (P < 0,05) a hodnota pH obou skupin se během skladování významně zvýšila (tabulka 1). Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky Marka a kol.⁶³, který poznamenal, že pH šťávy z kešu oříšků se po skladování po tepelném ošetření snížilo. Za zvýšení pH během skladování může být zodpovědná degradace pektinu a tvorba kyseliny galakturonové po enzymatickém ošetření. Hodnota pH vzorků ošetřených enzymy zůstala po celou dobu skladování mezi 4,05 a 4,31, zatímco pH neošetřené jablečné šťávy se pohybovalo mezi 4,12 a 4,33.
Celková kyselost (TA) jak u neošetřených, tak i u vzorků ošetřených lakázou vykazovala klesající trend s rostoucí dobou skladování (tabulka 1). Pokles kyselosti byl přičítán přeměně organických kyselin na sacharidy nebo enzymatickým reakcím, a také oxidaci během skladování šťávy.⁶⁴Celková kyselost kontrolní jablečné šťávy a vzorků ošetřených enzymy byla nižší než u jiných šťáv (jahodová šťáva 0,9 %, švestková šťáva 2,2 %, kumquatová šťáva 1,0 %, meruňková šťáva 2,4 %, pomerančová šťáva 0,8 %), ale podobná jako u jiných šťáv (např. hrušková šťáva 0,3 %).⁶²Tyto rozdíly v neošetřené čerstvě vymačkané jablečné šťávě mohou být způsobeny různými faktory, jako jsou pěstební podmínky, genetické faktory, úroveň zralosti a metody zpracování.⁶⁵Pokles celkové kyselosti kontrolní a lakázou ošetřené jablečné šťávy je v souladu s výsledky prezentovanými Singhem a kol.⁶⁶ohledně poklesu celkové kyselosti jablečné šťávy Jin Nuo po 74 dnech skladování. Na druhou stranu Oshmiansky a Wojdylo⁶⁷nezjistili žádné významné změny v kyselosti jablečné šťávy při studiu vlivu tradičních metod čiření.
Výsledky uvedené v tabulce 1 ukazují, že hodnota celkového obsahu rozpustných látek (TSS) v jablečné šťávě ošetřené lakázou byla vyšší než v neošetřeném vzorku. Tyto výsledky jsou v souladu s publikovanými studiemi.⁶⁸Tabulka 1 dále ukazuje, že hodnota celkového objemového součtu (TSS) kontrolní skupiny s jablečnou šťávou byla v počátečním časovém bodě 9,58 a na konci skladovací doby dosáhla 11,05. Tyto hodnoty jsou nižší než hodnoty TSS čerstvé jablečné šťávy uvedené Hamidem a kol.⁶⁹(11,2 a 11,80). Hodnota celkové rozpustné sušiny (TSS) vzorků jablečné šťávy ošetřené lakázou se významně zvýšila, počínaje 11,23 a po dvou týdnech skladování při 4 °C dosáhla 12,93 (tabulka 1). Podobný nárůst TSS během skladování byl pozorován také u citrusových plodů, citronů a sladkých pomerančů. Nárůst celkové rozpustné sušiny (TSS) během skladování může být způsoben hydrolýzou polysacharidů (škrobu) na monosacharidy (cukry), zvýšením koncentrace v důsledku dehydratace šťávy a degradací pektinu ve šťávě na rozpustnou sušinu. Nárůst celkové rozpustné sušiny (TSS) je pravděpodobně způsoben nárůstem rozpustných cukrů, které mohou vznikat přeměnou pektinu nebo celulózy na rozpustné cukry pektinem, respektive celulázou, nebo hydrolýzou škrobu na cukry, jak uvádějí Hamed a kol.^69.Vliv lakázy na vlastnosti jablečné šťávy lze pozorovat vizuálně, protože jablečná šťáva ošetřená lakázou vykazuje lepší tekutost a nižší viskozitu než neošetřená šťáva. Toto pozorování je zaznamenáno v tabulce 1; Viskozita vzorku ošetřeného enzymem byla 1,87 cP, zatímco viskozita kontrolního vzorku byla 2,95 cP. Toto významné snížení viskozity je pravděpodobně způsobeno vyšší schopností zadržovat vodu pektinovitých látek a tvorbou soudržné síťové struktury.
V této studii byl zkoumán vliv lakázy na index hnědnutí (BI) jablečné šťávy měřením absorbance při 420 nm pomocí spektrofotometru. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Během skladování vykazoval BI vzorků jablečné šťávy v ošetřené i neošetřené skupině postupný rostoucí trend. BI odráží stupeň hnědnutí a může sloužit jako...^důležitýindikátor enzymatických a neenzymatických reakcí hnědnutí. Absorbance se během skladování významně zvýšila (P < 0,05). Na konci skladování_A420Hodnota vzorků jablečné šťávy v kontrolní skupině a skupině ošetřené enzymy se zvýšila přibližně o 217 %, respektive o 121 % (tabulka 1). Výsledky ukazují, že ošetření enzymy může účinně snížit stupeň hnědnutí přibližně o 56 %. Výsledky Bezerry a kol.^[19]] jsou v souladu s našimi výsledky; K vyčeření jablečné šťávy použili kokosové vlákno lakáza-glutaraldehyd, čímž snížili její původní barvu o 61 %.
Přestože polyfenoly v ovocných šťávách mají pozitivní nutriční a terapeutické účinky na lidský organismus, mohou také reagovat s bílkovinami, což způsobuje zakalení šťávy, sedimentaci nebo zákal, čímž se mění chuť a vůně produktu a zkracuje se jeho trvanlivost.⁷¹Cílem této studie bylo bezpečně snížit obsah fenolických sloučenin v jablečné šťávě pomocí lakázy z Pleurotus ostreatus NRC 620. Výsledky uvedené v tabulce 1 ukazují, že celkový obsah fenolických sloučenin v jablečné šťávě ošetřené lakázou se před skladováním při 4 °C významně snížil. Celkový obsah fenolických sloučenin se navíc snížil i během skladování v obou studovaných vzorcích (tabulka 1). Výzkum Sandri et al.⁷²ukázaly, že jablečná šťáva ošetřená enzymy si může zachovat svou antioxidační aktivitu a obsah fenolických sloučenin. Výsledky studie Lettery a kol. však...⁷³ukazují, že ošetření pomerančové šťávy houbovou lakázou může snížit obsah fenolických sloučenin v ní až o 45 %.
Bylo prokázáno, že fenolické sloučeniny mají vlastnosti, jako je zachycování volných radikálů, redukce a zhášení singletového kyslíku, přenos atomů vodíku a dar elektronů volným radikálům, což z nich činí silné antioxidanty.⁷⁴V této studii byly proto k vyhodnocení vlivu lakázy na antioxidační aktivitu jablečné šťávy skladované v chladničce po dobu 14 dnů použity metody založené na DPPH a FRAP (tabulka 2). Obě metody prokázaly zvýšení antioxidační aktivity během skladování, což může být způsobeno zvýšením volných fenolických sloučenin nebo tvorbou produktů Maillardovy reakce (MRP), přičemž produkty Maillardovy reakce jsou pravděpodobně příčinou zvýšení antioxidační aktivity.⁷⁵Neenzymatické reakce hnědnutí (včetně degradace kyseliny askorbové, Maillardových reakcí a kyselinou katalyzované degradace cukrů) produkují hnědé pigmenty (melanoidiny). Meziprodukty degradace kyseliny askorbové a produkty degradace cukrů (jako jsou karbonylové sloučeniny) mohou reagovat s aminokyselinami prostřednictvím Maillardových reakcí.⁷⁶Přestože hnědnutí ovoce a zeleniny během skladování bylo rozsáhle studováno, naše chápání těchto reakcí zůstává omezené.⁷⁷Ve srovnání s metodou FRAP vykazovala jablečná šťáva ošetřená lakázou významně nižší antioxidační aktivitu metodou DPPH (tabulka 2) a antioxidační aktivita všech vzorků se s prodlužující se dobou skladování významně zvyšovala. V této studii byly použity dvě různé metody pro stanovení antioxidační aktivity, protože se jejich principy liší. Metoda DPPH měří schopnost neutralizovat volné radikály, zatímco metoda FRAP měří schopnost redukovat ionty železa. Proto se doporučuje použít více metod pro stanovení antioxidační aktivity, abychom lépe porozuměli antioxidační aktivitě studovaných vzorků.⁷⁸
Jedním z klíčových zjištění této studie je, že lakáza NRC 620 z *Pleurotus ostreatus* vykazuje optimální aktivitu při 70 °C a pH 3,0. Ve srovnání s jinými houbovými lakázami běžně používanými k čiření šťáv, jako jsou lakázy z *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum*, vykazuje *P. ostreatus* NRC 620 vyšší tepelnou stabilitu a kyselejší pH. Lakázy z *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum* obvykle vykazují optimální aktivitu v rozmezí 50–60 °C a při hodnotách pH mezi 3,5 a 5,0. Tento rozdíl může přispět ke zlepšení účinnosti čiření šťáv, zejména u kyselých šťáv, kde je stabilita při nižších hodnotách pH kritická. Jedinečnou vlastností *P. Ve srovnání s jinými studovanými houbovými lakázami vykazuje *Pleurotus ostreatus* NRC 620 schopnost efektivně fungovat i v náročnějších podmínkách. Jeho vyšší optimální teplota aktivity naznačuje potenciální výhody v průmyslových aplikacích, jako jsou rychlejší reakční rychlosti a snížená mikrobiální kontaminace. Jeho nízké pH, které je vhodné pro kyselou povahu mnoha šťáv, může být užitečné v procesech čiření šťáv. Tyto výsledky ospravedlňují další výzkum pro použití ve velkém měřítku, což činí z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 životaschopnou alternativu k tradičním zdrojům lakázy z hub. Ve srovnání s předchozími studiemi jsme zjistili, že optimální teplota je 60 °C a optimální pH je 3,0. Po reakci při 60 °C po dobu 80 minut si lakáza *Ganoderma lucidum* zachovala...⁴⁶% jeho aktivity.79 Podle Kurniawatiho a Nicelleho⁸⁰Enzymy *Ganoderma lucidum* vykazují vynikající až střední stabilitu při teplotě 25 °C a hodnotách pH v rozmezí 5,0 až 8,0 a stabilitu při pH 6,0 a teplotách v rozmezí 10 až 30 °C. V této studii jsme zjistili, že optimální pH a teplota pro aktivitu enzymu u *Pleurotus ostreatus* byly 3,0 a 70 °C. Po dvouhodinové inkubaci při 40 °C a 50 °C si enzym udržel 68,33 %, respektive 59,61 % své aktivity. Lakáza Pleurotus ostreatus NRC 620 navíc vykazovala vysokou aktivitu v širokém teplotním rozmezí od 50 °C do 80 °C, přičemž téměř dosáhla maximální aktivity (69 %–98 %), přičemž maximální aktivita byla pozorována při 70 °C.
Závěrem lze říci, že lakáza NRC620 z hlívy ústřičné, získaná za statických podmínek, prokázala optimální aktivitu a stabilitu v celém rozsahu pH a teplotních podmínek, což vykazuje vynikající stabilitu ve srovnání s jinými zdroji enzymů. Přidání 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ zvýšilo aktivitu enzymu přibližně o 21 %, respektive o 35 %. Po zpracování na jablečnou šťávu enzym snížil pH a viskozitu, zatímco obsah fenolů se během skladování snížil jen mírně.
Výsledky potvrzují potenciál lakázy v potravinářském průmyslu, zejména při čiření nápojů. Díky cílenému rozkladu fenolických sloučenin lakáza nejen snižuje zákal a zlepšuje čirost, ale také udržuje kvalitu ovocných šťáv za mírných provozních podmínek. Na rozdíl od tradičních čiřících činidel, jako je želatina, bentonit a silikagel, lakáza neprodukuje odpad ani neodstraňuje příjemné aroma z nápojů, což z ní činí ekologičtější a udržitelnější variantu. Navíc ve srovnání s jinými enzymy a filtračními metodami nabízí lakáza cílené a nákladově efektivní řešení bez kompromisů v kvalitě produktu.
Kyomuhimbo, HD a Brink, HG. Aplikace a imobilizační strategie lakáz obsahujících měď; přehled. Heliyon 9, e13156 (2023).